紫外可見分光光度計有一個根據(jù)儀器測試方法需要而設(shè)計的光度室( 又叫樣品室) 系統(tǒng)。光度室系統(tǒng)是使用者直接操作的地方。從單色器出來的單色光, 一般是通過一個小的透鏡射到比色皿上。比色皿中的試樣對單色光吸收一部分, 透過一部分。其透過部分射到光電接收器上由光電接收器變成電信號,送到電子學系統(tǒng)去放大、處理。
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紫外可見分光光度計光度室系統(tǒng)" src="../../news/pics/20140220/201402201392879355250.jpg"/>
光度室系統(tǒng)一般由光度室蓋、聚光透鏡、比色皿、比色皿架、石英窗片等組成。下面簡單介紹一下對光度室各部分的要求。
一、光度室蓋
光度室系統(tǒng)要求嚴防漏光。有的儀器在光度室蓋門的地方不密封, 房間的光可漏入光度室系統(tǒng), 使測試結(jié)果因雜散光增大而導(dǎo)致誤差增大。因此, 光度室蓋門的密封性很重要。尤其是使用者要經(jīng)常檢查光度室的密封性, 一定要嚴格做到光度室系統(tǒng)不漏光, 以減少雜散光, 保證分析測試結(jié)果的可靠性。
二、聚光透鏡
聚光透鏡將從單色器射出的發(fā)散光變成平行光, 再射到比色皿上。要求出射狹縫處在聚光透鏡的焦點上。聚光透鏡要求消色差。但有些普及型的紫外可見分光光度計儀器也有不用聚光透鏡的。但有些儀器要求不高, 為加強聚光能力, 聚光透鏡只是把從單色器射出的發(fā)散光直接聚在比色皿中央。
三、比色皿
比色皿( 又稱吸收池或樣品池) 是光度室的關(guān)鍵部件, 很多使用者往往不夠重視。在分析測試時, 一般是同時利用兩個分別盛有參比溶液和被測樣品溶液的比色皿, 對他們進行分別測試( 單光束或準雙光束儀器如此, 而雙光束儀器同時測試) , 比較測試的吸光度(或透射比, 一般都是比較吸光度)。因此,為了建立準確比較的基礎(chǔ), 對使用的比色皿的大小、形狀, 比色皿的兩塊透光面的平行度、光路長度、光譜特性等都應(yīng)該匹配( 配對)。即使是同一批生產(chǎn)的同一規(guī)格的比色皿, 其光路長度也不可能完全相等, 透光面的透光特性、幾何尺寸、透光面的平行度等都有可能有差異, 因此需要挑選配對使用。
比色皿幾何尺寸的誤差, 會給測試工作的結(jié)果帶來很大的誤差。這個由比色皿引起的分析誤差可以根據(jù)比耳定律計算出來。比耳定律A =εbC, 設(shè)比色皿的光程( 內(nèi)部幾何長度) b 的誤差為Δb, 則
式中Cx ———被測樣品的未知濃度;
C樣———標準樣品的已知濃度;
Ax ———被測樣品的吸光度測量值;
A樣———標準樣品的吸光度測量值。
特別是比色皿的配套誤差, 更應(yīng)引起使用者們的高度重視。設(shè)比色皿的配套誤差為ΔA, 則式( 3-7 ) 將變成
此時, 相對測量法比較依據(jù)的線性關(guān)系很可能因此遭到破壞。因此會帶來很大的測試誤差。
下面討論石英比色皿(QC) 不配對給紫外可見分光光度計帶來的分析誤差。
( 一) QC 不配對對單光束儀器分析誤差的影響
我們作過這樣的研究: 分別在60 只QC 中裝滿蒸餾水, 在北京普析通用的TU-1221 紫外可見分光光度計上測試, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)透過率都在80% 左右, 透過率稍大于80% 者有36 只, 稍小于80% 者有24 只。因此, 作者以透過率80%為基準, 依據(jù)作者過去的研究結(jié)果, 對用于紫外可見分光光度計的QC 作了進一步的分析。發(fā)現(xiàn)若單光束紫外可見分光光度計使用的QC 配對誤差為0. 5% T, 則QC 給使用者帶來的分析測試相對誤差ΔA/ A 為3%。這時, 即使使用的紫外可見分光光度計的光度準確度很高, 此QC 也不能在藥檢工作中使用。因為藥典要求藥檢中使用的紫外可見分光光度計的光度準確度, 一般相對誤差ΔA/ A 在1%以內(nèi)。同時, 此QC 也不能在要求高的科研工作中使用, 因為誤差太大。若QC 的配對誤差為0. 2%T , 則如果儀器的雜散光、噪聲都很小的話, 可勉強用在藥檢中。此時, QC 給使用者帶來的分析誤差(ΔA/ A)為1%。若QC 的配對誤差為0. 1% T , 則給使用者帶來的分析誤差(ΔA/ A)為0. 5%。此時, 若紫外可見分光光度計的性能很好, 則此QC 可以滿足各種高精度的分析工作的要求。這也就是日、美、英等發(fā)達國家對QC 的配對誤差要求達到0. 1%T 的原因。
( 二) QC 不配對對雙光束儀器分析誤差的影響
研究表明, 同一對QC, 在空池( 空氣) 和裝滿蒸餾水時, 在200nm 處的配對誤差是不一樣的。QC1-1 和QC1-2 為一對, 二者空池時的配對誤差為0. 01% T, 但二者裝滿蒸餾水后, 配對誤差為0. 55%T ; QC2-1 和QC2-2 為一對, 二者空池時配對誤差為0. 96% T, 但二者裝滿蒸餾水后, 配對誤差為1. 70% T; QC3 -1 和QC3 -2 為一對, 二者空池時的配對誤差為0. 11% T, 但二者裝滿蒸餾水后, 配對誤差為1. 15% T。由此可見: 檢驗QC 的配對誤差時, QC 中應(yīng)裝滿蒸餾水(或溶劑) ; 因為QC 為空氣時的配對誤差比裝滿蒸餾水(或溶劑) 時的配對誤差小。前者只能反映QC 透光面的光學特性帶來的誤差, 不能反映光程(加工的幾何尺寸) 帶來的誤差。因此, 所測得的配對誤差偏小。
雙光束紫外可見分光光度計也要求QC 配對, 因為即使QC 為空氣時, 只要有一個很小的配對誤差, 裝上溶液后配對誤差會很大, 致使儀器的自動調(diào)零調(diào)不回來, 會給分析測試結(jié)果帶來很大的誤差。
曾有質(zhì)檢部門在檢測紫外可見分光光度計時, 發(fā)現(xiàn)有五臺雙光束紫外可見分光光度計的光度準確度用標準溶液檢測時不合格。但是, 用標準片檢測、儀器都是合格的。后從QC 上找問題, 他們認真配對QC, 挑選了配對誤差為0. 2% T 的一對QC 來重新檢測, 結(jié)果這五臺雙光束紫外可見分光光度計全部合格。這說明QC 的配對誤差對雙光束紫外可見分光光度計也會產(chǎn)生嚴重影響。因此, 不管是單光束紫外可見分光光度計, 還是雙光束紫外可見分光光度計, 都對QC 的配對誤差有嚴格的要求。只不過是單光束紫外可見分光光度計比雙光束紫外可見分光光度計要求更高。
比色皿的配對、保存方法、使用方法都直接關(guān)系到分析測試結(jié)果的準確度和可靠性。油膩、指紋、灰塵、透射面上的任何沉積物都會嚴重影響比色皿的透光特性。因此, 比色皿在使用前后對它進行徹底清洗是必不可少的。在使用和清洗過程中, 不能用硬質(zhì)纖維和手指擦、摸透光面, 只能拿其不透光的兩個毛玻璃面。需要干燥的比色皿不能在爐子或火焰上加熱烘烤, 否則會引起比色皿的損壞或透光性能變壞。尤其是對配對使用的比色皿的影響更大。特別是比色皿被粘附力很強的試樣污染( 如木質(zhì)素、某些濃果汁等) 后很難清洗干凈, 即使是浸在“ 王水” 中也很難洗凈。一旦比色皿被黏附力很強的試樣嚴重沾污時, 儀器會出怪峰。這時, 可用超聲波清洗。一般常用20W 的清洗玻璃儀器的超聲波清洗30min , 就能解決問題。但絕對不能用大功率超聲波來清洗比色皿, 否則會損壞比色皿。特別是對那些用黏結(jié)方法制作的比色皿更要注意。
使用比色皿時, 還應(yīng)特別注意通光方向。由于比色皿的兩個通光面的材料不均勻, 兩個通光面的沾污情況不均勻, 所以不同的通光方向可能會引起光譜特性的變化, 從而影響分析測試時吸光度值的變化, 帶來分析誤差。一般比色皿的毛玻璃面上都刻有箭頭, 或在透光面上蝕刻有標記, 以供使用者辨認通光方向。
分析測試時, 注入比色皿的溶液不要太滿, 一般到比色皿高度的2/ 3 即可。如果萬一溶液或溶劑溢出, 則必須把比色皿透光面上的溶液或溶劑揩干擦凈, 否則會導(dǎo)入誤差。
四、比色皿架
比色皿架很重要, 它也是光度室的關(guān)鍵部件。一般常規(guī)分析的紫外可見分光光度計, 通常只有可放兩只比色皿的固定池架。但比色皿架有多種, 在環(huán)保、生化等領(lǐng)域使用的紫外可見分光光度計, 就有許多不同規(guī)格的比色皿架,如雙聯(lián)池、五聯(lián)池、八聯(lián)池等。比色皿架一定要求靈活、定位準確, 因此, 它的機械加工很重要。有的紫外可見分光光度計的比色皿架往往容易卡死或不能處在正確的位置上, 結(jié)果嚴重影響測量的準確度和重復(fù)性。
比色皿架的各個透光孔的尺寸、形狀應(yīng)均勻一致, 透光孔前后兩個面都應(yīng)平行, 并垂直于光軸。各個透光孔進入光路后, 其正中心都應(yīng)與單色器出射、入射狹縫的中心、光電接收器的中心同時處在整個光學系統(tǒng)的光軸上。一般來講, 各個透光孔的尺寸要求小于單色器的出射狹縫高度和光電接收器前的光欄孔的尺寸, 以防比色皿架的定位不準或位槽間隙過大時, 單色器的出射狹縫和光電接收器前的光欄孔的邊緣擋光。
對一般手動儀器在檢查比色皿架各透光孔透光的一致性時, 可僅拉動比色皿架( 架中不放比色皿) , 讓比色皿架的某個透光孔先進入光路, 讀取其透光度的值。一般要求該透光孔的透光度為90%以上, 然后將各個透光孔依次進入光路, 測量其透光度值, 再進行比較。對自動調(diào)節(jié)透光度100% 的單光束儀器, 可先測得第一比色皿架透光孔的透光度, 然后參照上述方法, 測量各透光孔的透光度值, 再進行比較, 得出比色皿架各透光孔的透光一致性。對于雙光束儀器, 如果在使用時各個透光孔未進行雙光束補償, 則必須對各孔的透光度一致性進行檢查。當各透光孔的透光度一致時, 則只需對一孔的透光度進行補償。如果發(fā)現(xiàn)比色皿架各透光孔的透光性不一致時, 首先檢查比色皿架對活動座架的位置、彈簧軸輪的運動情況、注意透光孔邊緣有無纖維、薄塵等因素影響。在不得已的情況下, 對透光孔進行加工, 以達到各孔透光的一致性。
